真菌菌株检测
一、样本采集与预处理
样本类型
环境样本：土壤、水体、谷物等需无菌采集，优先选择污染或霉变区域。
生物样本：动物组织（如肠道内容物）、植物病斑组织需低温保存运输，防止菌株失活。
前处理流程
富集培养：使用选择性培养基（如PDA培养基）分离目标真菌，25–28℃培养3–7天，观察菌落形态。
毒素辅助筛查：对疑似产毒菌株（如镰刀菌属），同步检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等毒素，采用ELISA法快速初筛。
二、菌株鉴定方法
形态学鉴定
菌丝与孢子特征：显微镜观察菌丝分枝、隔膜及孢子形态（如镰刀菌的镰刀形分生孢子）。
菌落特征：记录菌落颜色（白色→粉红→紫色）、边缘形态及生长速度，辅助区分镰刀菌、曲霉等属。
分子生物学鉴定
ITS序列分析：扩增真菌ITS1/ITS4区域，测序比对NCBI数据库，鉴定至种水平（如Fusarium graminearum）67。
多重PCR检测：针对特定毒素合成基因（如Tri5基因簇）设计引物，验证产毒能力。
三、功能与毒性评估
产毒能力检测
HPLC/UPLC法：定量分析DON等毒素，Agilent ZORBAX C18色谱柱分离，检测限达0.1 μg/kg78。
细胞毒性实验：通过红细胞溶血试验或Caco-2细胞模型评估毒素对肠道屏障的破坏效应。
耐药性分析
抗生素敏感性测试：采用微量肉汤稀释法测定菌株对临床抗生素（如万古霉素、达托霉素）的MIC值。
耐药基因检测：宏基因组测序结合qPCR技术，分析耐药基因（如vanA、liaR）的丰度与表达水平。
四、检测流程标准化
步骤 方法 适用标准
样本前处理 无菌采集+富集培养 ISO 21527-1:2008
毒素筛查 ELISA法/免疫亲和柱净化 GB 5009.111-2016
分子鉴定 ITS测序+多重PCR AOAC 2013.07
毒性验证 细胞毒性实验+HPLC定量 GB 31660.5-2021
五、质量控制要点
交叉污染防控
实验分区操作（样本处理区、PCR区、测序区），紫外线灭菌30分钟/次。
阴性对照设置：使用无菌水替代样本，排除试剂污染。
数据验证
毒素检测需加标回收实验（回收率85–110%），HPLC峰面积RSD≤5%。
测序结果需双向验证，序列相似度≥99%判定为同种。
六、技术发展趋势
快速检测：开发便携式LAMP试剂盒，30分钟内完成镰刀菌属特异性检测。
多组学整合：结合代谢组学分析毒素合成通路，预测菌株致病潜力。